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游离DNA提取方法的选择有哪些?
点击次数:128 发布时间:2019-07-28
 
游离DNA提取方法一般有TRizol方法、离心柱法、磁珠法。其中,Trizol方法与离心柱相比,提取效果相当,但是因其对操作者带来的毒性,现在越来越被弃用。磁珠法比较适合机器自动化提取,如果没有核酸提取仪,只是使用磁力架配套提取,磁珠法的操作就比较麻烦且容易导致样本交叉污染。另外,根据研究,磁珠法的核酸提取得率不如离心柱法。如果要提取的游离核酸的量比较低,zui好选择离心柱法。对于游离DNA含量较低的样本或比较珍贵的样本或样本总数不是很多的实验室,第一想到的是核酸提取方法应是离心柱法。离心柱法游离DNA提取原理主要是样本裂解后,DNA在高盐条件下与硅胶膜结合,再在低盐、高PH值时将DNA从硅胶膜上洗脱下来。面对各种品牌的离心柱法提取试剂盒,哪种才是最适合的呢?目前国内常用的离心柱法游离DNA提取试剂盒有国内品牌Biog、国际品牌Q、国内品牌T等。
我们以下就几种游离DNA提取试剂盒进行比较。一、有较高的提取得率。核酸提取得率的确定,常用的是使用紫外分光光度计的方法。但是,血清、血浆样本中游离核酸含量较低,如果直接用紫外法检测,得出的数值并不准确,而且多次测量的结果会变异很大。关于提取得率,Qiagen的研究数据是1ml正常血浆样本cfDNA得为7.35ng左右,但如果白细胞大量凋亡,血浆中的游离DNA量会有所增加,肿瘤病人血浆中的DNA会大幅增加。有些研究者提取血浆核酸后习惯于先用紫外检测浓度,发现紫外检测不出来或浓度很低时便认为提取失败,放弃后面进一步的实验,其实并不可取。我们可以把紫外读数作为参考,但是不能作为判断得率的标准,zui好还是要做个PCR或荧光定量。根据Qiagen公司的实验,血清血浆的量与提取的核酸量成正比。因而,如果要提高核酸得率,可通过增加血清或血浆的量来实现。一般地,做血浆或血清核酸提取,样本量zui好在1ml以上。如果1ml或更大量样本得不到满意的检测结果,则应及时考虑更换提取试剂盒。目前国内常用的血浆核酸提取试剂有国际品牌Q、国内品牌T、国产品牌Biog等,我们实验室使用下来,Biog的核酸提取得率较高,1ml肺癌病人血浆样本DNA得率在85ng左右,Q的得率在72ng左右,T的得率在63ng左右,基本上都能满足下游PCR实验的需求。当然,如此低的浓度直接测OD值不太容易,如果使用Nanodrop2000c,其检测下限为2ng/ul。如洗脱液为30ul,则需要1ml左右的血浆才能检测出来。显然,如果是健康人的血浆,1ml血浆的DNA浓度更低,紫外可能根本就检测不出来。因而,血浆DNA提取完成以后,zui好直接做PCR,紫外检测的意义不大。

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