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免疫组化染色流程中的难题及防范措施
点击次数:162 发布时间:2019-05-22
       良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要实验人员不懈努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:无色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。
  一无色片
  染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。这是比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能:1、真阴性结果:整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果:即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况:(1)切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况,可能是实验人员选择错了切片或选错了抗体。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明:制作出合格的免疫组化切片是至关重要的。(2)染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
  解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时待测样本仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时zui好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。另一种称为“外部对照”,有时在待测的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了解决这个问题,目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片等,其连续切片储备待用,需要时取出一张便可作为阳性对照。另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照,因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。

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