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临床FFPE核酸提取试剂盒的操作中哪些更有利于正确结果
点击次数:416 发布时间:2019-03-18
临床FFPE核酸提取试剂盒为从经福尔马林固定石蜡包埋组织(简称FFPE)中提取DNA提供一种高质量、快速、高效的方法。本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统。可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。使用本试剂盒提取DNA无需用二甲苯去蜡,操作简单、安全。提取所得的DNA可直接应用于PCR等下游实验。
1.将石蜡样品切成5-10μm厚的切片。注意:若石蜡块保存于室温,则弃去起始的2~3片切片。切片厚度以5μm为佳,适当去除无组织的蜡质可提高提取效率。
2.将4-8片切片置于1.5-mL离心管中(自备),加入300μL除蜡液DB。
3.将离心管置于80℃孵育30min,期间10min后取出短暂涡旋混匀。
4.于室温冷却2-3min,加入10μL的蛋白酶K,涡旋混匀,55℃孵育30-60min至无明显组织块。(视组织量的多少,可酌情减少或增加孵育时间。)
5.13,000rpm离心1min。用枪头小心刺穿液面表层蜡膜,取下层清液至新的1.5-mL离心管中(自备)。
注意:切勿吸到上层浑浊蜡层,否则石蜡可能对DNA纯度有影响。
6.加入400μL裂解液LB,颠倒混匀,室温静置10min。
7.加入800μL无水乙醇,涡旋10sec。
8.将吸附柱置于2-mL收集管中,再将上述液体转移至吸附柱中,每次加入750μL,13,000rpm离心1min,弃收集管中的滤液。
9.重复步骤8,直至将所有溶液都经过吸附柱过滤,弃滤液。
10.向吸附柱中加入已用无水乙醇配制的洗涤液WB1500μL,13,000rpm离心1min,弃废液。
11.将吸附柱重新放回2-mL收集管中,加入600μL洗涤液WB2,13,000rpm离心1min,弃废液。
12.重复步骤11两次。
13.将吸附柱重新放回2-mL收集管中,于室温13,000rpm空柱离心1min后,置于新的1.5-mL无核酸酶污染的离心管中。开盖室温静置或超净工作台风干5min,以彻底挥发残余的乙醇。
注意:残留的乙醇可能会影响后续的PCR等实验。
14.向吸附柱柱膜中央上方小心加入35-100μL无核酸酶污染的纯水(此步骤请谨慎操作,枪头请勿接触柱膜,纯水经65℃温浴后再加入有助于提高洗脱效率),室温静置3-5min,13,000rpm离心1min,洗脱液即为DNA溶液。(建议:为提高DNA浓度,可将洗脱液重新加回柱膜中央,静置3min后,以13,000rpm离心1min洗脱DNA。)

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